РАЗРАБОТКА НОВЫХ МАРКЕРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ КАМЧАТСКОЙ МИКИЖИ PARASALMO (ONCHORHYNCHUS) MYKISS
Камчатская микижа Parasalmo (Oncorhunchus) mykiss является пластичным высокополиморфным видом лососевых рыб, отличающимся сложной популяционной структурой. Генетическое разнообразие вида на североамериканском и азиатском участках ареала изучено неравномерно. Наряду с многочисленными работами, посвященными генетике различных форм микижи Северной Америки (и их интродуцентов, выращиваемых и распространенных по всему миру), популяционно-генетические исследования азиатской группы P. (O.) mykiss невелики [1—3].
Исследование особенностей генома этого вида показали, что большинство маркеров, широко используемых в генетических исследованиях североамериканских форелей, малоэффективны или просто непригодны для микижи в азиатской части ареала. Очевидно, что дальнейшее исследование генетического разнообразия вида требует разработки новых маркерных систем и методик поиска подходящих популяционно-генетических маркеров. Нами были использованы SCAR-маркеры и ISSR-марке-ры, подобранные по достаточному для популяци-онного анализа уровню видоспецифичного полиморфизма [3].
SCAR-маркеры [4], берущие начало от полиморфных RAPD-маркеров, лишены большинства их недостатков и применимы для разнообразных исследований. Для получения локус-специфичных маркеров интересующий фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученной нуклеотидной последовательности подбирают длинные высокоспецифичные праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости.
ISSR-маркеры [5] — это межмикросателлитные участки, амплифицированные с использованием микросателлитных локусов как участков отжига прай-меров. Праймеры состоят из повторяющейся последовательности и "якорного" участка на 5' или 3' конце, который определяет место отжига прайме-ра. Такой подход увеличивает точность отжига, воспроизводимость амплифицированных фрагментов и уменьшает "анонимность" амплифицируемых участков. Праймеры подбирались нами по ранее выявленным у микижи микросателлитным последовательностям.
Целью настоящей работы явилась проверка результативности использования данных маркерных систем для популяционно-генетического анализа микижи.
Материал и методы
Материал был собран от разных форм Parasalmo (O.) mykis, обитающих в наиболее крупных реках и водных бассейнах западной и восточной Камчатки, чилийской микижи, а также североамериканских популяций. Учитывая, что данный вид представлен разными эпигенетическими вариациями, в анализ были включены особи речной (резидентной) и проходной форм. Принадлежность к той или иной форме подтверждалась анализом чешуи и содержанием Sr/Ca в отолитах. Всего было исследовано 7 популяций О. mykiss (речная и проходная формы из рек Сопочная и Утхолок с западного побережья Камчатки, речная форма из р. Коль с западного побережья Камчатки, речная форма из р. Жупанова с восточного побережья, рыборазвод-ная выборка микижи из Чили, североамериканская микижа: прибрежная — coastal и материковая — inland формы; в качестве репера был использован наиболее близкий к микиже вид Oncorhynchus ma-sou). В каждую выборку было отобрано по 21 экземпляру.
ДНК выделяли из замороженной мышечной ткани стандартным методом, включающим лизис клеток 3%-м саркозилом Na, инкубацию лизата с про-теиназой К и депротеинизацию смесью фенол-хлороформ и хлороформ—изоамиловый спирт. Амплификацию SCAR-маркеров проводили по полученным ранее в нашей лаборатории семи парам SCAR-праймеров следующих последовательностей:
1) сс§££сасс1аса££с1§аайс£ и tgagggca (t отжига 65°),
2) tgatgtcaccttgtccccttaatg и сactgcactctgggaagcctaact (t отжига 65°), 3) gccttctttgcgaaacattgtaaaacctcc и gca-atactagtgtttaagctactttttgaa (t отжига 65°), 4) ccctagtcttt-gtggttgaatctg и actggagtggagcaaatgttagcg (t отжига 68°), 5) ctggaggctaagaggacgagagga и ttcctagtggctcagtgtgggtca (t отжига 71°), 6) ccgtctcctctctgatagctgtgc и ggccttctttg-tctatttcctcac (t отжига 65°), 7) gtgtattctccatctcccctcttg и ttctttgtgggttcgactataggc (t отжига 65°).
Амплификацию при ISSR-анализе проводили с ранее подобранными ISSR-праймерами: 1) (cag)7t (t отжига 69°), 2) (cag)5 (t отжига 62°), 3) (tga)6tc и (agac)4agat (t отжига 63°), 4) (agac)4agat (t отжига 66,5°). Реакцию проводили в объеме 25 0,01 М буфера Tris-HCl, pH 8,3, содержащего 0,05 М KCl, смесь четырех dNTP (0,1—0,2 mM), MgC12 (5mM), двух или одного праймеров по 2 на пробу, Smart-Taq ДНК-полимеразы (Диалат, Россия) и 100 нг исследуемой ДНК. Полимеразную цепную реакцию проводили по следующим программам: 1) для SCAR-маркеров — "горячий старт" 94° — 5 мин, (94° —
1 мин, t° отжига — 1 мин, 72° — 1 мин) х 35 циклов; 2) для ISSR-маркеров — "горячий старт" 94° — 5 мин, (94° — 45 с, t° отжига — 45 с, 72° — 45 с) х х 40 циклов.
Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в агарозном геле (GenePure LE, BioExpress) в ТВЕ буфере. В качестве маркеров молекулярного веса использовали 1 kb "Ladder" фирмы "СибЭнзим", Россия. Гель окрашивали 0,05% бромистым этидием, промывали водой и анализировали в ультрафиолетовом свете.
Результаты и обсуждение
При использовании, сконструированных нами уникальных SCAR-праймеров амплифицировался единственный фрагмент по размеру чуть меньше исходного полиморфного RAPD-фрагмента. Для контроля амплификации мы использовали фрагмент гена 18 S RNA. Проверка полученных маркеров, имеющих полиморфизм по GenBank, показала, что ни одна из последовательностей не имеет выраженного сходства с представленными в нем последовательностями. Все полученные SCAR-маркеры обладают высоким меж-популяционным полиморфизмом, хорошо сочетающимся с географическим положением популяций.
На рис. 1 видно, что SCAR-маркер, присутствующий у 82% индивидов из р. Коль, присутствует только у 33% индивидов из р. Жупанова.
Рис. 1. Полимофный SCAR-профиль: (1—17) микижа из р. Коль (западное побережье камчатки, (18—35) ми-кижа из р. Жупаново (восточное побережье Камчатки). Маркер 1 kb SibEnzim
Рис. 2. Пример полиморфного КЗЯ-профиля: (1—8) микижа из р. Седанка (западное побережье Камчатки), (1—9) микижа из р. Жупанова (восточное побережье Камчатки), т — маркер 1 кЬ
Проведя предварительный анализ отношений между тестовыми выборками с помощью различных методов, мы получили отношения, хорошо коррелирующие с географической локализацией исследуемых популяций. При оценке популяционных отношений методами объединения соседей (Neighbour joining, NJ) и UPGMA образовывались два крупных кластера, уверенно поддерживаемых бутсреп-анали-зом (100%). Один из них включал в себя североамериканскую микижу (материковую и прибрежную формы), а также чилийскую форель. Близость чилийской и североамериканской групп хорошо объясняется тем, что многие реки Чили зарыблялись как раз североамериканской форелью. Другой кластер включает в себя популяции с западного побережья Камчатки. Популяция с восточного побережья Камчатки (микижа из р. Жупанова) отличается по данным маркерам от рек западного побережья и находится ближе к североамериканским форелям.
При анализе тех же популяций микижи по четырем ISSR-локусам были получены профили, также указывающие на достаточно высокие популяци-онно-генетические различия у камчатской микижи (рис. 2) Характер отношений между популяциями, выявляемый методами NJ и UPGMA, в целом сходен с таковыми, полученными при анализе SCAR-
маркеров. В один из образующихся кластеров входят популяции из рек западного побережья Камчатки, а во второй — материковая и прибрежная формы североамериканской микижи, микижа из р. Жупа-нова с восточного побережья Камчатки и чилийская форель.
Таким образом, можно утверждать, что ЗСАЯ-и КЗЯ-маркеры могут быть высоко результативны при исследованиях больших выборок камчатской микижи и других лососевых видов. Более подробно отношения между камчатскими и другими популяциями вида Рата$а1шо (О.) шук1$$ будут рассмотрены в последующих работах. Однако уже очевидно, что новые маркерные системы, не используемые ранее для лососевых рыб, помогут в решении многих спорных вопросов при популяционно-генетическом
анализе сложнокомплексных видов.
* * *
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 08-04-01217), грантом "Научные школы" (НШ-2104.2008.4) и грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (госконтракт 02.740.11.280).
С.Д. Павлов, М.Н. Мельникова, А.Л. Сенчукова, Е.А. Пивоваров
(кафедра ихтиологии биологического факультета МГУ; e-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.)