МИКРОБИОЦЕНОЗ РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ В САДКОВЫХ ХОЗЯЙСТВАХ СЕВЕРНОЙ КАРЕЛИИ
В Карелии широкое распространение получило садковое рыбоводство - направление аквакультуры, где производится выращивание радужной форели [11]. Форелевые хозяйства служат своеобразным типом местообитания для аллохтонных микроорганизмов, поступающих с кормом, а также с разводимой рыбой и продуктами ее метаболизма [2], а загрязнение органического происхождения приводит к структурно-функциональным изменениям в составе местной микрофлоры [13].
Негативное влияние симбионтного взаимодействия микроорганизмов с рыбой способствует бурному развитию ассоциаций бактерий, повышающих свои патогенные свойства. Динамика симбионтов в таких условиях постоянно меняется и заложена в высоком адаптационном потенциале как рыбы, так и бактерии. Благодаря высокой приспособляемости к агрессивным факторам среды усиливается ферментная активность бактерий, в результате чего симбионтные отношения в системе меняются в сторону доминирующих групп.
Таким образом, бактериальные показатели приобретают важное индикаторное значение, позволяя выявить различные источники и типы антропогенного воздействия [1], [9].
Эффективность методов микробиологического анализа при мониторинге водоемов рыбохозяйственного назначения доказана на примере исследований, проводимых в Мурманской области [4]. Учитывая слабую изученность микрофлоры радужной форели в садковых хозяйствах Карелии, подобные исследования даже по одному из таких водоемов представляют научный и практический интерес.
Цель работы - изучение микробиоценоза радужной форели из садковых хозяйств на севере Карелии, работающих в течение одного года. Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
1. Определить таксономический состав микрофлоры радужной форели в садковых хозяйствах на севере Карелии с небольшим периодом работы.
2. Дать численную характеристику гетеротрофных бактерий в микрофлоре рыб.
3. Изучить возможность применения бактериальных показателей для оценки степени структурно-функциональных изменений в составе микрофлоры форели.
Микробиоценоз радужной форели в садковых хозяйствах Северной Карелии
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Отбор проб на рыбоводных предприятиях проведен в период с апреля по сентябрь 20082009 годов согласно определенной нормативнотехнической документации, содержащей необходимые требования, нормативы качества и методы исследования [10]. С помощью бактериологических методов изучен микробиоценоз радужной форели (Parasalmo mykiss irideus), выращиваемой на форелевых хозяйствах Карелии в акватории озер Хедо и Муй (система реки Кемь, бассейн Белого моря).
Для выделения бактерий и их дальнейшего изучения у живой рыбы стерильно получены образцы кожи и жабр. Далее проведены посевы на плотные питательные среды общего (рыбо-пептонный агар, рыбо-пептонный бульон), специального (Эндо, Пешкова) и дифференциально -диагностического (Кесслера - для обнаружения бактерий группы кишечной палочки) назначения для изучения морфологических, культуральных и биохимических свойств бактерий. Дополнительно использованы среды: висмут-сульфит агар - для обнаружения бактерий, образующих сероводород (сальмонеллы); Плоскирева и Левина - для выявления не разлагающих лактозу патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae; Сабуро - для селективного выделения дрожжеподобных и плесневых грибов.
Для описания морфологических свойств бактерий мазки окрашены по Граму, а затем исследованы при помощи светового микроскопа с иммерсией. Подвижность бактерий фиксирована при фазоконтрастном микроскопировании и по росту на полужидкой (0,3-0,7 % агара) среде. Ге -молитическая активность бактерий проверена по гемолизу на чашках Петри с 5 %-м кровяным агаром. Для дифференциации представителей рода Pseudomonas от бактерий сходных с ними родов определена оксидазная активность культуры, способность расщеплять глюкозу и тип дыхания микроорганизмов в среде Хью-Лейфсона (тест окисления-ферментации).
Для установления систематической принадлежности изучаемых микроорганизмов использован определитель [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В формировании микробиоценоза форели, разводимой в хозяйствах с периодом работы один год (озера Муй и Хедо), участвуют 5 групп бактерий, представленных 8 семействами и 5 родами. Диапазон изменений количественных показателей гетеротрофов варьирует в пределах от 101 до 103 КОЕ/мл. Выделенные ассоциации микроорганизмов состоят как из сапрофитных, так и из условно-патогенных бактерий.
В результате анализа данных по бактериальной обсемененности кожных покровов и жабр молоди радужной форели из озера Муй в 2008-2009 годах достоверно выявлено (P < 0,05), что на коже максимальная численность бактерий (302 ± 113 КОЕ/мл) соответствует периоду май 2009 года (температура воды - 6,5 °С), минимальная (18 ± 4 КОЕ/мл) - декабрь 2008 года (1,4 °С). На жабрах максимальная численность бактерий (1533 ± 62 КОЕ/мл) соответствует периоду сентябрь 2008 года (11,7 °С), минимальная (47 ± 20 КОЕ/мл) - декабрь 2008 года (1,4 °С) (рис. 1).
Полученные данные согласуются с общим представлением о том, что температурный фактор определяет интенсивность всех микробиологических процессов в воде, в том числе значение показателей численности [12], где невысокая бактериальная обсемененность совпадает с наступившим в это время холодным сезоном года (декабрь). Весенний подъем численности микробного числа характеризует прогревание водоема до благоприятных температур. Для рыбных хозяйств приведенные данные могут означать следующее: нетипичное низкое обсеменение в летний и осенний периоды, когда развитие бактериопланктона достигает своих максимальных значений, следует рассматривать как сигнал неблагополучного влияния на водоем со стороны самого предприятия, например из-за применяющихся в лечении рыб антибактериальных препаратов широкого спектра действия и др. Так, к примеру, анализ проб воды из садка на одном из форелевых хозяйств в южной части Карелии в летний период позволил определить численность, не превышающую 101 КОЕ/мл.
В период наиболее высокой численности бактерий в воде (сентябрь 2008 года) кожа рыб контаминирована незначительно - 123 ± 30 КОЕ/мл, в то время как на жабрах отмечена максимально высокая бактериальная численность - 1533 ± 62 КОЕ/мл. В течение всего исследования жабры были более обсемененными, чем кожа (P < 0,05). В сентябре 2008 года на жабрах грамположительная микрофлора (66,7 %) доминирует над грамотрицательной (33,3 %). По литературным данным [17], микробное число на жабрах может варьировать в широких пределах с 6*102 до 2,2*106. Считаем, что в сентябре 2008 года у исследованной группы рыб была превышена численность бактерий 1,5 *103 КОЕ/мл по сравнению с остальными сезонами. Причиной тому могло послужить внешнее повреждение жаберного эпителия в результате воздействия различных стрессовых факторов - загрязнение воды органическими веществами, скученность, низкое содержание кислорода, повышенное количество аммиака, сортировка рыбы [8]. Известно, что бактериальная обсемененность кожных покровов и жабр, а также внутренних органов тесным образом связана с условиями содержания рыб в садках. При неудовлетворительном состоянии воды из-за применяемых мер по интенсификации производства повышается уровень бактериального загрязнения. Одна из причин - высокая плотность посадки рыб, которая способствует поступлению в водоем большого количества продуктов их метаболизма (органическое вещество), а несъеденные остатки корма только дополняют картину [1], [2], [6]. К примеру, из литературы известно, что на одном из рыбоводных хозяйств у карпа отмечалась значительная обсемененность покровов и органов, вызванная изначальным пребыванием посадочного материала в условиях предприятия с проводимыми на нем интенсификационными мероприятиями [5]. Не исключена также возможность инвазии тканей жаберного аппарата. К примеру, по результатам паразитологических и микробиологических исследований промысловых рыб дельты Волги [8] было установлено, что на фоне увеличения интенсивности инвазии наблюдалось повышение численности бактерий у рыб, однако качественные характеристики микробиоценоза оставались неизменными и соответствовали составу окружающей водной среды.
В ходе исследований установлено, что качественный состав микробиоценоза молоди форели из озера Муй представлен 7 семействами (Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Mi-crococcaceae, Listeriaceae, Vibrionaceae, Bacil-laceae, Neisseriaceae), 4 родами (Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Listeria). В целом полученные результаты соответствуют литературным данным. По сообщениям ряда авторов, в составе микрофлоры рыб часто встречаются условнопатогенные микроорганизмы, среди которых представители семейств Pseudomonadaceae (род Pseudomonas), Vibrionaceae (род Aeromo-nas) и Enterobacteriaceae [1], [2], [3], [6], [14]. На коже и жабрах распространены бактерии родов Aeromonas, Pseudomonas, Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Escherichia, Cytophaga, Flavobacte-rium, Micrococcus, Staphylococcus, Enterococcus [15], [16].
У исследованных рыб на коже доминируют представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas - 79,2 %). Выделенные штаммы - прямые палочки, окрашиваются по Граму отрицательно, обладают подвижностью. Аэробы, метаболизм чисто дыхательного типа (тест O/F в среде Хью-Лейфсона). Оксидазо- и каталазоположительные, не декарбоксилируют лизин и орнитин. Вторыми по частоте встречаемости являются бактерии из семейства Enterobacteriaceae (8,3 %) - прямые палочки, грамотрицательные. Обладают и дыхательным, и бродильным типом метаболизма (среда Хью-Лейфсона). Оксидазо-отрицательные. Остальные группы Vibrionaceae, Bacillaceae (род Bacillus) и Listeriaceae (род Listeria) выделяются с одинаковой частотой (4,2 %). На жабрах микробиоценоз в основном представлен бактериями из семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas - 72,7 %), затем следуют представители семейства Enterobacteriaceae (9,1 %), а семейства Bacillaceae (род Bacillus), Micrococ-caceae (род Micrococcus), Listeriaceae (род Listeria) и Neisseriaceae составляют по 4,5 % соответственно.
Во все периоды отбора проб на молоди форели из озера Муй доминирующее положение занимали представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas).
Осенью 2008 года на долю псевдомонад приходится 50 %, а к концу года - 76,5 %. К весне 2009 года количество псевдомонад возрастает до 77,8 %, а к осени 2009 года они полностью (100 %) составляют микробиоценоз рыб, потеснив остальных представителей (рис. 2).
Для псевдомонад зарегистрирован максимальный коэффициент Симпсона (C), который составляет от 0,25 до 1. Сопутствующая псевдомонадам микрофлора меняется в сезон. В сентябре 2008 года представлены семейства Bacillaceae (род Bacillus - 33,3 %) и Micrococcaceae (род Micrococcus - 16,7 %) с коэффициентами Симпсона 0,11 и 0,028 соответственно. В декабре 2008 года встречаются представители семейства Enterobacteriaceae (5,9 %, коэффициент 0,003), и только в этот период, когда покровы рыб сильно контаминированы грибами, выявлены представители семейств Neisseriaceae и Listeriaceae (род Listeria) (5,9 % и 11,8 % с коэффициентами 0,003 и 0,014). Весной 2009 года впервые появляются бактерии из семейства Vibrionaceae (5,6 %, коэффициент 0,003).
Микробиоценоз радужной форели в садковых хозяйствах Северной Карелии
В микробиоценозе кожи и жабр представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas) в течение года не только доминируют над остальными бактериями, но к сентябрю 2009 года вытесняют их полностью. Доминирование палочковидных форм бактерий у рыб выступает индикатором загрязненности водоема и усиленных процессов эвтрофикации. В начале исследований отмечен высокий удельный вес бактериальных штаммов с гемолитической активностью и подвижностью, что обусловливает их патогенность.
Исходя из этого мы считаем, что подобная видовая сукцессия служит сигналом неблагополучия в экосистеме. Несмотря на то, что псевдомонады относятся к представителям нормальной микрофлоры рыб [6], при определенных условиях, будучи условно-патогенными, вызывают эпизоотии, особенно когда занимают доминирующее положение. Как отмечают исследователи [3], к псевдомонадам восприимчивы большинство видов пресноводных и морских рыб. В условиях бесконтрольного применения антибиотиков на рыбоводных хозяйствах были зафиксированы случаи вспышек псевдомоноза. Особое значение приобрели бактерии Ps. fluorescens var. capsulata, которые за счет своей капсулы оказались более устойчивыми к применению антибактериальных препаратов, потеснив многие виды сапрофитных микроорганизмов. В результате псевдомонады прочно заняли доминирующее положение в водоеме, резко ухудшив эпизоотическую ситуацию.
Изучение бактериальной обсемененности кожных покровов и жабр молоди радужной форели из озера Хедо позволяет достоверно (P < 0,05) установить, что на коже максимальная численность бактерий (2396 ± 8 КОЕ/мл) соответствует периоду сентябрь 2008 года (температура воды - 11,7 °С), минимальная (39 ± 12 КОЕ/ мл) - сентябрь 2009 года (10 °С). На жабрах максимальная численность бактерий (2132 ± 31 КОЕ/ мл) соответствует периоду сентябрь 2008 года (11,7 °С), минимальная (58 ± 14 КОЕ/мл) - декабрь 2008 года (1,5 °С) (рис. 3).
Температурный фактор здесь также сыграл ключевую роль в определении уровня обсемененности - небольшая численность отмечена в подледный период, с последующим повышением за счет прогревания водоема. В период посадки молоди форели в садки (сентябрь 2008 года) на озере Хедо отмечена наивысшая численность бактерий (более 2 тыс. КОЕ/мл) на коже и жабрах по сравнению с другими сезонами (рис. 3). По нашему мнению, причиной такой разницы могло быть стрессированное состояние, в котором находилась рыба после недавней перевозки. Возможно, этим же объясняется дальнейшее более высокое микробное число в течение исследования у форели из озера Хедо, чем у форели из озера Муй. Низкая численность бактерий (менее 70 КОЕ/мл) выявлена в декабре 2008 года, что соответствует наиболее холодному сезону года (температура воды 1,5 °С). Однако в сентябре 2009 года при более высокой температуре воды (10 °С) установлена такая же низкая бактериальная обсемененность форели, как в декабре 2008 года, но, возможно, уже из-за антропогенного воздействия, поскольку санитарное качество воды к концу исследований становится все менее удовлетворительным. Самые низкие показатели численности зафиксированы в зимний период при температуре воды 1,4 °С и осенний 2009 года при температуре воды 10 °С.
По результатам исследований получены данные, характеризующие качественный состав микробиоценоза молоди форели из озера Хедо. Микрофлора рыб представлена 6 семействами (Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Micrococcaceae, Listeriaceae, Vibrionaceae, Saccharomycetaceae), 3 родами (Pseudomonas, Staphylococcus, Listeria).
В микробиоценозе кожи доминируют представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas - 41,7 %) - грамотрицательные прямые палочки, подвижные. Аэробы, метаболизм чисто дыхательного типа (тест O/F в среде Хью-Лей-фсона). Оксидазо- и каталазоположительные, не декарбоксилируют лизин и орнитин. Обладают аргининдегидролазой. Далее идут семейства Vib-rionaceae (25 %) и Enterobacteriaceae (20,8 %). Доминирующим в микробиоценозе жабр является семейство Pseudomonadaceae (род Pseudomonas - 55,9 %). Представители семейства Vibrionaceae составляют 17,6 %, а семейства Enterobacteriaceae - 11,8 %.
По результатам сезонной встречаемости бактерий на коже и жабрах молоди форели установлено разнообразие микробиоценоза во все периоды исследования, кроме начального (сентябрь 2008 года), где выделяются исключительно представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas - 100 %) (рис. 4).
Значение показателя Симпсона у псевдомонад в сентябре 2008 года составляет 1 (для Ps. aeruginosa и Ps. alcaligenes С = 0,005; Ps. stutzeri С = 0,08; Ps. syringae С = 0,02; для остальных псевдомонад С = 0,184). В остальные сезоны (декабрь 2008 - сентябрь 2009), наряду с псевдомонадами (декабрь 2008 год - 47,4 %; май 2009 года - 52,6 %; сентябрь 2009 года - 33,3 %), встречаются представители семейства Enterobacteriaceae (декабрь 2008 года - 21,1 %; май 2009 года - 10,5 %; сентябрь 2009 года - 20 %). В мае и сентябре 2009 года стабильно присутствуют бактерии семейства Vibrionaceae (удельный вес 36,8 и 33,3 % соответственно). Бактерии семейств Micrococ-caceae (род Staphylococcus) и Listeriaceae (род Listeria) обнаружены лишь в декабре 2008 года (коэффициенты Симпсона 0,011 и 0,044).
В начале исследований удельный вес бактериальных штаммов с гемолитической активностью и подвижностью отмечен как самый высокий, что обусловливает их патогенность, а в микробиоценозе форели установлено видовое однообразие, где доминируют только представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas), дополнительно указывая на негативную ситуацию в акватории. Похожая картина отмечена для микрофлоры форели из озера Муй, где также преобладают псевдомонады и отмечена их эпизоотическая и экологическая роль.
Таким образом, определена наиболее низкая бактериальная обсемененность молоди форели из водоема Муй, где посадка малька производилась на несколько месяцев раньше, чем у рыб из водоема Хедо. Качественный состав микробиоценоза более разнообразен у форели, выпущенной в садки раньше (озеро Муй), и отличается присутствием представителей семейств Vibrionaceae, Bacillaceae и Neisseriaceae. Схожими составы оказываются в семействах Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Micrococcaceae и Listeriaceae. В микрофлоре рыб доминируют представители семейства Pseudomonadaceae (род Pseudomonas), но больше их отмечено для форели из озера Муй (76,1 %), чем из озера Хедо (58,5 %).
ВЫВОДЫ
Анализ полученных материалов показал, что таксономический состав микрофлоры рыб представлен 8 семействами (Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Neisseriaceae, Micrococcaceae, Bacillaceae, Listeriaceae, Saccha-romycetaceae), 5 родами бактерий (Pseudomonas, Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria).
На изученных форелевых фермах в микробиоценозе радужной форели доминируют условно-патогенные бактерии семейства Pseudomonadaceae рода Pseudomonas. При создании неблагоприятных условий для макроорганизма они могут повышать свою вирулентность и способны инфицировать стрессированную (ослабленную) рыбу.
Численность бактерий на коже и жабрах радужной форели из хозяйств с периодом работы около одного года (озеро Муй и Хедо) варьирует в пределах 101-103 КОЕ/мл при разных сезонных условиях среды и особенностях рыбоводных техник. Это отражает высокую значимость температурного фактора в развитии бактериопланктона и индикаторной роли значений численности микроорганизмов для определения качества водной среды и эффективности проводимых профилактических мероприятий.
АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ ПАРШУКОВ
кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории паразитологии животных и растений, Институт биологии Карельского научного центра РАН (Петрозаводск, Российская Федерация) ecologya84@gmail. com
НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА СИДОРОВА кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакологии, организации и экономики фармации, микробиологии и гигиены медицинского факультета, Петрозаводский государственный университет (Петрозаводск, Российская Федерация) Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.