Оценка качественного состояния молоди тихоокеанских лососей перед выпуском в естественные водоемы

Сроки проведения комплексного биолого-морфофизиологического обследо- вания молоди тихоокеанских лососей приурочены к ее выпуску с лососевых ры- боводных заводов или к окончанию технологического цикла при ее двухлетнем выращивании, а также совпадают с покатной миграцией природной молоди – в течение III декады мая – II декады июля.

Сбор материала для морфофизиологической оценки проводится однократно перед выпуском молоди в естественные водоемы и в случае ее двухлетнего со- держания – однократно по окончании каждого технологического цикла.

В целях проведения более объективной характеристики биологического каче- ства заводской молоди ее оценка проводится по вычислению средневзвешенных показателей у молоди, выращенной в разных условиях (или у молоди разных воз- растных групп) на одном заводе.

Для этого используют следующую формулу:

Мср = ((Р1 ? M1) + (Р2 ? M2) + (Р3 ? M3) +... + (Рn ? Mn)) / (P1 + Р2 + Р3 +...+ Pn),

 

где: Мср – средняя масса тела всей молоди; Р1, Р2, Р3, Рn – количество молоди соответственно в первом, втором, третьем и последнем бассейне, шт.; М1, М2, М3, Мn – средняя масса тела молоди соответственно в первом, втором, третьем и последнем бассейне, г.

Пример расчета: В трех бассейнах содержится 2100 тыс. экз. молоди кеты. В каждом бассейне определена средняя масса тела молоди:

- в 1-м круговом бассейне содержится 500 тыс. экз. молоди средней массой тела 1,0 г;

- во 2-м круговом бассейне содержится 600 тыс. экз. молоди средней массой тела 0,700 г;

- в 3-м бассейне дальневосточного типа содержится 1000 тыс. экз. молоди средней массой тела 0,400 г.

Необходимо вычислить среднюю массу тела молоди, находящейся в трех бас- сейнах.

Мср = ((500 ? 1,000) + (600 ? 0,700) + (1000 ? 0,400)) / (500 + 600 + 1000) =

= (500 + 420 + 400) / 2100 = 1320 / 2100 = 0,629 г.

Следовательно, средняя масса тела молоди кеты, выращенной во всех трех бассейнах завода, составляет 0,629 г.

Объем сбора проб молоди с каждого завода для ее качественной оценки мо- жет быть неодинаковым и зависеть от количества и условий ее содержания перед выпуском (подращивание в круговых бассейнах при низких или повышенных тем- пературах воды, прямоточных бассейнах дальневосточного типа, в естественных выростных прудах и т. д.). Количество экземпляров в общей пробе по каждому заводу должно составлять не менее 100 экз.

Рыба измеряется по следующим показателям: длина тела по Смитту – АС, длина до конца чешуйного покрова – АD, масса тела – Р, масса желтка – Рж, а так- же индексам внутренних органов (относительные массы): печени, сердца и желу- дочно-кишечного тракта (Правдин, 1966; Шварц и др., 1968; Смирнов и др., 1972). Кроме того, проводится расчет коэффициента упитанности по Фультону – Кф.

Физиологическая оценка молоди проводится по гематологическим показате- лям: количеству эритроцитов и лейкоцитов в единице объема крови (1 мм3), со- держанию гемоглобина (г/л), соотношению форменных элементов крови и плазмы (по величине гематокрита, %), а также морфологической картине крови по наибо- лее часто применяемым схемам (Остроумова, 1957, 1966; Канидьев, 1966, 1967, 1969; Иванова, 1983; Мусселиус и др., 1983).

Сбор крови для анализа осуществляется из хвостовой артерии малька в ге- паринизированный микрокапилляр (пипетку Сали) объемом 20 мкл. При работе с молодью очень мелких размеров и невозможности взятия крови в этом объеме на микрокапилляр наносят отметку, делящую его надвое. Таким образом, набирают уже не 20, а 10 мкл крови.

В исследовании на определение содержания эритроцитов, гемоглобина и ве- личины гематокрита в связи с малым количеством крови у одного малька исполь- зуются в основном усредненные пробы (от 2 до 10 мальков в 1 пробе).

Общее количество экземпляров молоди, израсходованной на один полный ге- матологический анализ, зависит от массы тела рыб и может составлять от 15 экз. (крупноразмерная молодь в возрасте годовики – двухлетки) до 200 экз. (мелко- размерная молодь в возрасте сеголетка), а на биологический анализ – не более 25 экз. (крупноразмерная молодь) и не более 100 экз. (мелкоразмерная молодь).

Для забора крови мальков от 1 до 7 экз. в зависимости от их размеров рас- кладывают в ряд на фильтровальную (рис. 90) или другую бумагу, хорошо впиты-

119

вающую влагу, сложенную в несколько слоев, таким образом, чтобы у края бумаги свисала их нижняя часть тела.

Отсечение хвоста у малька делается в непосредственной близости от ануса. Ножницы должны быть очень острыми, чтобы не получилось рваных краев в этом месте, из-за чего может быть затруднен забор крови. То есть она будет попадать в пипетку Сали порционно и будет в ней «завоздушиваться». При этом не получится забрать точное количество крови. Пипетку для забора крови нужно держать кон- чиком вниз под наклоном 40–45o. Перед каждой процедурой забора крови пипетку Сали обрабатывают в растворе гепарина в разведении 1:5000 Мед. и полностью выдувают из него этот раствор, чтобы снова не получилось «завоздушивания» крови в пипетке.

Определение количества эритроцитов в единице объема крови Количество эритроцитов оценивается пробирочным методом с помощью каме- ры Горяева и микроскопа, например «Leiса». При подсчете эритроцитов использу- ется лабораторный счетчик СЛ-1.

Для полноценного анализа на определение общего количества эритроцитов должно заполняться 10 пробирок, в которые наливают градуированной пипеткой по 4 мл 0,85%-го физиологического раствора, изготовленного в аптеке. В случае забора крови в объеме не 20, а 10 мкл наливают в 2 раза меньше этого раствора, т. е. всего по 2 мл. Затем в подготовленные пробирки выдувают кровь, осторожно промывая капилляр несколько раз. К камере Горяева притирают покровное стек- ло до образования ньютоновских колец. По истечении 1–2 мин содержимое уже можно рассматривать. Для этого пипеткой Сали после промешивания, заполнения содержимым пробирки и удаления его первой капли заполняют камеру Горяева. Затем начинают подсчет эритроцитов под микроскопом в 5 больших или в 80 ма- лых квадратах, расположенных по диагонали (рис. 91а).

120

а б Рис. 90. Отсечение хвостовой части тела (а) и сбор крови (б) у мальков кеты в гепаринизированный капилляр

а б Рис. 91. Схема подсчета эритроцитов в камере Горяева: а – 80 малых (5 больших) квадратов, расположенных по диагонали, в которых необходимо считать эритроциты; б – расположение эритроцитов (окрашены на схеме в черный цвет), которые следует считать в 1 из 5 больших квадратов (в 16 малых квадратах)

Подсчет эритроцитов в каждом из 5 больших квадратов, в состав которых вхо- дит 16 малых квадратов, ведется следующим образом: считают все эритроциты, расположенные в центре большого квадрата, а также справа, снизу и в нижнем левом углу.

Количество эритроцитов в 1 мкл крови определяют по формуле:

Х = (А ? 4000 ? 200) / 80,

где Х – количество эритроцитов в 1 мкл крови; А – количество подсчитанных эри- троцитов в 80 малых или 5 больших квадратах; 4000 – множитель, приводящий результат к объему 1 мкл; 200 – рабочее разведение; 80 – число просчитанных малых квадратов.

Для упрощения подсчетов количества эритроцитов в 1 мкл крови достаточно умножить их число, просчитанное в 80 малых или в 5 больших квадратах (А), на 10 000.

Количество подсчитанных эритроцитов записывается или в млн шт./мм3 крови, или в тыс. шт./мм3 крови.

Определение содержания гемоглобина в единице объема крови Содержание общего гемоглобина, также как и при проведении анализа на ко- личество эритроцитов в единице объема крови, определяется пробирочным спо- собом и с помощью современного портативного фотоэлектрического гемоглоби- нометра «МиниГЕМ-523» (рис. 92). Измерение концентрации гемоглобина в крови проводится гемиглобинцианидным методом.

Для измерения концентрации гемоглобина достаточно опустить в фотоме- трическую ячейку прибора кювету с приготовленным раствором крови, и через мгновение на дисплее появится значение концентрации. Пересчет оптической плотности раствора в концентрацию гемоглобина производится автоматически.

121

Рис. 92. Портативный гемоглобинометр «МиниГЕМ-523» с автокалибровкой

Прибор не нужно включать, «прогревать», калибровать перед измерениями. При опускании кюветы в фотометрическую ячейку гемоглобинометр автоматически включается, производит измерение и индицирует измеренную концентрацию. По- сле извлечения кюветы из фотометрической ячейки гемоглобинометр переходит в режим «ожидания» до следующего измерения.

В 10 пробирок градуированной пипеткой наливают по 2 мл заранее приготов- ленного Сали кровь 0,04%-го в объеме раствора 20 или NH 10 3

. мкл Затем выдувают собранную в пробирки в гепаринизированную пипетку с раствором, и через 2 с уже можно проводить измерение гемоглобина.

Перед этим проверяют гемоглобинометр на точность планируемых измерений. Для этого достают специальный светофильтр (контрольная мера) с трансформи- рующим раствором, входящий в комплектацию гемоглобинометра, на котором указано – 133±5. Затем его вставляют в фотометрическую ячейку для измере- ний. На дисплее прибора должна высветиться цифра 133 или погрешность в ту или другую сторону не более 5. Если данные на дисплее прибора соответствуют цифре, указанной на контрольной мере, или цифрам в пределах погрешности, то можно проводить измерение гемоглобина.

Для этого в пустую кювету, входящую в комплектацию прибора, выливают со- держимое пробирки, затем вставляют ее в фотометрическую ячейку и снимают показания прибора. В случае малого забора крови, т. е. в объеме 10 мкл, показа- ния умножаются на 2. Содержание гемоглобина измеряется в г/л.

Содержание гемоглобина в одном эритроците Содержание гемоглобина в одном эритроците (СГЭ) определяется по форму- ле Гительзона, Терскова (1956):

СГЭ = (Гемоглобин г% / Число млн эритроцитов в 1 мм3) ?10 мкмкг/эритроцит.

Определение гематокрита Гематокрит определяют путем центрифугирования гепаринизированных ка- пилляров с кровью в гематокритной микроцентрифуге МГ-6-02 (рис. 93а).

Микроцентрифуга (частота вращения 6500 об/мин) предназначена для одно- временного разделения крови в 6 капиллярах с целью последующего определе- ния гематокритного числа крови.

 

а б

в Рис. 93. Оборудование и расходные материалы для определения гематокрита: а – гематокритная микроцентрифуга МГ-6-02, б – гепаринизированные капилляры, в – герметик

Сбор крови для определения гематокрита осуществляется специальными гепаринизированными капиллярами, входящими в комплект микроцентрифуги. Один конец капилляра окрашен в красный цвет (рис. 93б). Заполнять капилляр кровью нужно с его прозрачного конца. В целях повышения точности измерений в капилляр набирают как можно больше крови, при этом ее забора до конкретного объема не требуется.

Для того чтобы кровь при центрифугировании не вытекла наружу, капилляр со стороны красной отметки аккуратно, путем ввинчивания закупоривают герметиком (рис. 94в). Однако, чтобы перед закупоркой кровь случайно не вытекла из капил- ляра, капилляр с кровью аккуратно встряхивают вниз к красной отметке.

Закупоренные капилляры красным концом вниз в количестве 6 шт. устанавли- вают в ячейки. Закрывают плотно крышкой и включают меню «Пуск». Центрифуга вращается в течение 4 мин. После окончания вращения капилляры достают из центрифуги, прикладывают по одному к цифровому дисплею и снимают резуль- таты.

 

Для предупреждения дисбаланса важными условиями при проведении цен- трифугирования являются следующие: центрифуга должна стоять на абсолютно ровном устойчивом месте, и при недоборе капилляров с кровью в пустые ячейки вставляют пустые капилляры.

Соотношение объема эритроцитов к общему объему крови вычисляется в %. Оценка морфологической картины крови В целях определения морфологического состава периферической крови рыб изготавливаются мазки. Схема их изготовления проиллюстрирована на рис. 94.

Рис. 94. Схема изготовления мазка крови

Используются специально предназначенные для этих целей предметные стек- ла – они обезжирены и очень чистые. В противном случае мазок не получится, форменные элементы крови будут деформированы и в дальнейшем мазок будет нечитабельным.

У малька отсекается хвост, и капля крови, стекающая с тела малька, наносит- ся на одну сторону предметного стекла. Для равномерного распределения капли крови по предметному стеклу используется специально подготовленное предмет- ное стекло со шлифованным на одном его торце ребром. Это стекло со шлифо- ванной стороны прикладывается к капле крови под углом 45o, кровь растекается по шлифованной стороне равномерно. Это же стекло с кровью равномерно прово- дят вперед по предметному стеклу, на которое наносится мазок.

С другой торцовой стороны мазка ставят отметки: дата проведения работ, вид рыбы, место проведения работ и т. д. (рис. 95).

Необходимо учитывать, что на мазке крови не должно быть много крови, так как в дальнейшем будет очень сложно идентифицировать ее форменные элементы.

Оценка морфологической картины крови проводится по 10–15 мазкам. Мазки предварительно высушиваются, а затем фиксируются и окрашиваются в раство-

ре Май-Грюнвальда. Докрашивание препаратов проводится в краске азур-эозин по Романовскому. Зрелость клеток красной крови (уровень эритропоэза), а также соотношение форменных элементов белой крови (лейкоцитарная формула) опре- деляются по существующим классификациям (Остроумова, 1957; Иванова, 1983). Оценка и подсчет форменных элементов крови на мазке проводятся на раз- личных его участках по следующей схеме (рис. 96).

Рис. 96. Схема оценки форменных элементов крови на мазке

Для подсчета степени зрелости клеток эритроидного ряда считают не менее 1000 эритроцитов по всему полю мазка. Затем считают соотношение зрелых, мо- лодых и юных форм эритроцитов (%). Для подсчета разных видов и степени зре- лости лейкоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов) обычно считают не менее 100 штук. В случае малого количества лейкоцитов счи- тают все лейкоциты по всей площади мазка.

Подсчет количества лейкоцитов в единице объема крови На зафиксированном и окрашенном мазке крови рыб сначала определяется количество лейкоцитов на 1 тыс. эритроцитов путем подсчета данных клеток при просмотре 4–6 тыс. эритроцитов. Мазок просматривают согласно схеме оценки форменных элементов крови (рис. 96).

Для подсчета общего числа лейкоцитов в единице объема крови (в 1 мкл или в 1 мм3) используется общее число эритроцитов в крови в единице ее объема (в 1 мкл или мм3) и количество эритроцитов на 1 тыс. эритроцитов.

Для подсчетов используется формула:

Х = (Kэр ? Kл / 1тыс.) / 1000,

где: Х – количество лейкоцитов, шт. в 1 мм3 крови; Кэр – количество эритроцитов, шт. в 1 мм3 крови; Кл/1 тыс – усредненное количество лейкоцитов на 1 тыс. эритро- цитов; 1000 – количество эритроцитов.

Рис. 95. Правильно подготовленный мазок крови

Пример расчета: Количество эритроцитов, подсчитанное пробирочным способом, составило 1 100 000 шт./мм3.

Усредненное количество лейкоцитов на 1 тыс. эритроцитов при просчете 5 тыс. шт. эритроцитов составило 4,2 шт.

X = (1 100 000 ? 4,2) / 1000 = 4 620 000 / 1000 = 4620 шт. лейкоцитов в 1 мм3 крови.